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ELISA相關問題與解答

瀏覽次數: 日期:2014-10-15

摘要:

1、ELISA檢測所用的樣本怎樣進行採取和保存?

說明:大多數ELISA檢測使用血清或血漿作爲樣本。可以根據常規方法收集血清樣品。應注意避免溶血。當紅細胞溶解時,釋放出具有過氧化物酶活性的物質。在HRP標記的ELISA測定中,溶血樣品可增加非特異性着色。血清樣品應進行新鮮檢測。如果存在細菌污染,細菌可能含有內源性HRP,這也可能產生假陽性反應。通常,在5天內測量的血清樣品可以放置在2-8℃。樣品在冰箱中儲存太長時間,導致血清IgG的聚合,尤其是間接試劑的背景;在一週內測量的樣品需要 - 在20°C或更低溫度下儲存。冷凍血清後,蛋白質部分濃縮,分佈不均勻。應徹底混合,避免氣泡。具有濁度或沉降的血清樣品應在澄清前進行離心或過濾。反覆冷凍和解凍將導致抗體滴度下降,因此如果需要將測試抗體的血清樣品儲存用於多次測試,則應將其少量儲存。應在無菌條件下保存血清,並可加入適當的防腐劑。由於纖維蛋白原干擾,不完全抗凝的樣本是假陽性,建議儘可能使用抗凝,特別是肝素抗凝劑。

2、ELISA檢測時如何保證有效洗滌?

解釋:洗滌是將特異性結合固相的抗原或抗體與反應溫育期間吸附的非特異性組分分離,以確保ELISA測定的特異性。因此,洗滌平板是ELISA測定的極其重要的部分。

1)強烈建議使用全自動洗衣機清洗,洗手容易造成交叉污染;

2)定期對洗衣機進行維護。使用前檢查是否有孔堵塞。吸氣,注射和走路的操作是否正常。通常,吸吮後每孔的殘留量不超過2ul,並注入液體。每孔的量超過250ul,但不能溢出,並設定一定的浸泡時間,60秒/次,至少5次。

3、ELISA實驗比色中單波長和雙波長的區別?

說明:

1)中檔和以上微孔板讀取器基本上具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長測量選擇在450nm波長下的比色測量,終止後黃色液體的最大吸收,並獲得每個孔。 A值,其中A值包括液體的液體顏色的吸收值(W1)和非特異性吸收值(W2),非特異性吸收值通常是指紋的值,劃痕,孔和孔底部的灰塵等。值,然後W1=A-W2,我們在比色時設置空白零,即將其減去非特定吸收值。實際上,並非每個孔都具有相同的非特定吸附值,因此單波長測量存在一定程度的不確定性,即不同的空穴位置可能獲得不同的吸光度值,但僅在可接受的範圍內。

2)雖然波長是雙色的,但是酶標儀每次在450nm的敏感波長和諸如630nm的非敏感波長下測量。測量敏感波長的吸光度作爲吸光度的特定顏色和板孔上的指紋,劃痕,灰塵等。吸光度之和(M1);在非敏感波長下測量,特定顯色的吸光度值爲零,測得的吸光度是污垢的吸光度值(M2),最後是酶標儀給出的值,它是吸光度值之間的差值在敏感波長和極端波長處的吸光度值(A=M1-M2)。因此,當測量比色時,優選使用雙波長比色。

3)選擇雙波長比色時,無需將空白孔設爲零。如果空白孔仍然調整爲零色,則可能存在吸光度爲負的現象。

4、ELISA檢測試劑敏感度偏低的處理方法?

說明:
1)重新實驗,並注意對試劑盒溫度平衡,培養時間,顯色時間等影響因素的控制; 2)檢查質量控制產品是否反覆凍融,質控產品是否有測定內差異,質控產品是否長時間在2~8℃;4)重新評估控制的可靠性; 5)由於各種因素,樣本本身似乎是弱陽性,實際上是陰性樣本; 6)由於樣品本身含量低,很容易隨實驗水平波動。這部分樣品的處理應格外小心,合格的使用者應進行驗證性實驗; 7)注意檢查實驗中使用的儀器和設備是否定期校準; 8)注意實驗中使用的板的批號和酶標準試劑是否相同,不應混合不同批號的試劑。

5ELISA產品檢測時,出現本底偏高或者“花板”現象的主要原因分析?

說明:

洗滌的原因:

1)各製造商使用的洗滌液的配方根據各試劑的條件製備。使用不合適的洗滌液往往不能達到正常洗滌效果,這主要導致背景過高甚至花板現象。該公司的洗滌系統不建議與其他公司的工具包混合使用。

2)用於配置乳液的水應爲新鮮蒸餾水或去離子水。如果使用自來水,水中含有過多的Ca2 +和Mg2 +。這些離子將佔據表面活性劑,影響洗滌效果,以及水中一些微生物的內源性來源。有性物質會引起干擾和過高的非特異性反應。

3)清洗板時,應確保洗衣機中的液體注入量和剩餘液體量能正常使用,否則會影響洗滌效果。一般來說,液體注射量需要300-350μl/孔,但不應溢出,避免交叉污染,殘留量≤2μl,洗滌至少5次。

顯色系統的原因:

1)基材B液體稍微變色,導致高背景。

2)不正確使用尖端和樣品罐進行清洗也會干擾基材A和B的非特異性反應。

樣本自我理由:

1)使用溶血樣品,當紅細胞溶解後,具有過氧化物酶活性的物質將被釋放,這將增加非特異性的顏色發展;血清樣本陳舊,如果有細菌污染,細菌可能含有內源性HRP。會增加非特定的顏色發展。

2)使用抗凝血不完整的樣本,由於纖維蛋白原干擾引起的非特異性發色,建議儘量不要抗凝,尤其是肝素抗凝樣本。

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